GMP級干細(xì)胞培養(yǎng)的挑戰(zhàn)和發(fā)展趨勢

2024. 06. 25

干細(xì)胞在細(xì)胞治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)以及制藥和生物技術(shù)應(yīng)用方面具有巨大前景。它們具有自我更新的能力，并能夠根據(jù)分離來源分化成特定的細(xì)胞類型。然而，干細(xì)胞在臨床應(yīng)用中的使用需要高質(zhì)量和大量的細(xì)胞，這需要大規(guī)模擴(kuò)增干細(xì)胞。傳統(tǒng)的細(xì)胞維持和擴(kuò)增方法依賴于使用平面塑料培養(yǎng)板和異種培養(yǎng)基的2D培養(yǎng)技術(shù)，這些方法的擴(kuò)增有限，細(xì)胞在長期傳代后往往會失去克隆和分化能力。干細(xì)胞的3D擴(kuò)增新方法強(qiáng)調(diào)3D細(xì)胞生長以模擬體內(nèi)環(huán)境。本文將簡要介紹干細(xì)胞3D擴(kuò)增系統(tǒng)中微載體、生物反應(yīng)器以及培養(yǎng)基等的上游工藝的最新進(jìn)展以及策略選擇。

微載體的選擇

微載體選擇是一個(gè)重要參數(shù)，因?yàn)樗鼈兊奈锢砗突瘜W(xué)特性會影響細(xì)胞培養(yǎng)行為。在設(shè)計(jì)基于微載體的干細(xì)胞培養(yǎng)的上游生物工藝策略時(shí)，應(yīng)考慮微載體的不同物理和化學(xué)特性，包括尺寸（大、小、微）、孔隙率（無孔、微孔和大孔）、形狀（球形、圓柱形和圓盤形）以及表面改性（細(xì)胞外基質(zhì)涂層、化學(xué)改性、正或負(fù)表面電荷）。未經(jīng)表面處理和/或涂層的微載體表現(xiàn)出有限的貼壁能力。這可以通過添加功能基團(tuán)、ECM 或聚合物涂層來修改其表面，以增強(qiáng)細(xì)胞附著和細(xì)胞存活率。例如Cytodex 1微球是葡聚糖微球，由于包含二乙氨基乙基 (DEAE) 基團(tuán)而帶正電荷，可改善細(xì)胞粘附。類似地，微載體也可以使用ECM分子和生長因子覆蓋。但一個(gè)需要考慮的因素是，目前大多數(shù)微載體的涂層材料都是異種的，如膠原蛋白和層粘連蛋白，因存在潛在危險(xiǎn)化合物而限制了其在臨床級干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。一個(gè)解決方案是重組ECM類似物。通過在微載體表面加入 ECM 蛋白來改善細(xì)胞附著，從而解決細(xì)胞貼壁問題，保證未分化細(xì)胞的長期擴(kuò)增。此外，在微載體表面加入生長因子代表了開發(fā)可支持干細(xì)胞增殖和生長因子遞送的治療性生物活性微載體的一種新方法。

尺寸和孔隙率是微載體的另一項(xiàng)重要特性，因?yàn)樗鼈儧Q定了微載體的表面積和沉降速率，而沉降速率可顯著影響細(xì)胞的擴(kuò)增和產(chǎn)量。即使細(xì)胞附著不受微載體尺寸影響，該參數(shù)也會影響細(xì)胞聚集形態(tài)，可以探索通過在微載體制造過程中測試不同尺寸來最大限度地增加使用微載體時(shí)不同干細(xì)胞的數(shù)量。就孔隙率而言，微球既可以制成無孔顆粒，也可以制成多孔顆粒。微孔微球（孔隙占總面積的 60% 以下）可增加表面積、細(xì)胞粘附和生長。這些微孔微載體特別方便改善灌流系統(tǒng)中的細(xì)胞截留。同樣，在微孔微載體上培養(yǎng)的細(xì)胞可以輕松地從培養(yǎng)基中獲取存活和增殖所需的因子。相反，大孔微載體（其中孔隙占總面積的 60% 到 90%）顯著減少了細(xì)胞附著表面。此外，由于細(xì)胞尺寸約為 10 μm，這些微載體允許細(xì)胞進(jìn)入其結(jié)構(gòu)并在其內(nèi)部生長，從而改善因子和氣體的擴(kuò)散。因此，大孔微載體的主要優(yōu)點(diǎn)是在使用攪拌或灌流系統(tǒng)時(shí)免受剪切應(yīng)力的影響，以及改善微環(huán)境，在使用無血清培養(yǎng)基時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞的活力和生長。

此外，微載體的形狀是與沉降速度密切相關(guān)的一個(gè)參數(shù)。低沉降速度（<30 cm/min）會阻礙循環(huán)和混合，導(dǎo)致營養(yǎng)和氣體供應(yīng)不足，從而降低細(xì)胞活力和產(chǎn)量。研究表明，圓柱形微載體會產(chǎn)生緊湊的細(xì)胞-微載體聚集體，而球形微載體會誘導(dǎo)更開放的聚集體結(jié)構(gòu)和更薄的細(xì)胞層。最重要的是，細(xì)胞擴(kuò)增和多能性標(biāo)志物不會因微載體的形狀而減少。

盡管很多研究已經(jīng)通過使用不同的材料、改變尺寸、形狀和孔隙率或用不同的材料進(jìn)行微載體涂層來克服低粘附性和細(xì)胞生長的問題，但其中大多數(shù)都使用異種材料。在這方面，該領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)之一是用當(dāng)前和新興的無污染元素取代傳統(tǒng)的異種元素。另外，微載體的選擇還必須考慮其它因素，例如培養(yǎng)系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)最佳的干細(xì)胞工藝。

培養(yǎng)體系的選擇

由于通常從天然來源獲得的干細(xì)胞數(shù)量較少，GMP級干細(xì)胞培養(yǎng)面臨的主要挑戰(zhàn)之一是選擇最佳擴(kuò)增系統(tǒng)。該系統(tǒng)必須使用無異種培養(yǎng)基、生長因子和添加物擴(kuò)增未分化狀態(tài)的干細(xì)胞。3D生物反應(yīng)器是克服靜態(tài)培養(yǎng)限制的可行選擇，因?yàn)樗鼈兲峁┝艘粋€(gè)可放大的系統(tǒng)，其中可以監(jiān)控和控制操作因素。

關(guān)于培養(yǎng)系統(tǒng)的首要選擇要素是生物反應(yīng)器的類型，必須考慮擴(kuò)增細(xì)胞的最終應(yīng)用。例如，攪拌罐生物反應(yīng)器是相對簡單的培養(yǎng)系統(tǒng)，由一個(gè)帶有攪拌槳的容器組成，攪拌槳攪拌內(nèi)部物質(zhì)以提供均勻的培養(yǎng)液。此類培養(yǎng)系統(tǒng)已成功測試了在無異種條件下擴(kuò)增不同類型的干細(xì)胞，包括間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 (iPSC) 和胚胎干細(xì)胞（ESC）。使用這些系統(tǒng)時(shí)需要關(guān)注產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，可能會損壞對剪切敏感的細(xì)胞，通過控制攪拌槳的形狀和攪拌速度，可以最大限度地減少這一問題。

該類生物反應(yīng)器系統(tǒng)中必須監(jiān)測和控制的另一個(gè)重要參數(shù)是氧飽和度。在不同 O2濃度下培養(yǎng)的干細(xì)胞可能在細(xì)胞增殖、活力和分化能力方面表現(xiàn)出顯著差異。一些研究測試了在低氧飽和度（約 5%）下培養(yǎng)iPSC和 ESC，在缺氧條件下觀察到細(xì)胞從有氧到無氧途徑的顯著代謝變化。但這種情況導(dǎo)致乳酸濃度升高，培養(yǎng)基的 pH 值從中性變?yōu)樗嵝?。?dāng)在 ESC培養(yǎng)中使用 30% 的氧飽和度時(shí)，實(shí)現(xiàn)了更高的代謝和細(xì)胞生長率。

生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)對于臨床級干細(xì)胞的擴(kuò)增至關(guān)重要，并且必須完全符合GMP法規(guī)，而生物反應(yīng)器容器特性（例如材料、尺寸和形狀）是影響細(xì)胞生產(chǎn)并最終影響生物工藝成本的關(guān)鍵參數(shù)。生物反應(yīng)器的材料和設(shè)計(jì)應(yīng)便于清潔和生產(chǎn)步驟，從而防止任何污染的可能性。在這方面，一些生物反應(yīng)器系統(tǒng)已經(jīng)開發(fā)出使用一次性裝置作為避免清潔過程和降低污染風(fēng)險(xiǎn)的新策略。

上述系統(tǒng)可以與微載體結(jié)合，從而將系統(tǒng)的特性與其融合在一起，所以，未來的趨勢可能集中在探索這些具有不同微載體特性的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，以針對特定的干細(xì)胞類型，最大限度地提高細(xì)胞產(chǎn)量，同時(shí)保持其活力和多能性。

培養(yǎng)基和添加物

維持和擴(kuò)增干細(xì)胞所需的培養(yǎng)基、生長因子、細(xì)胞因子和其它添加物是上游生物工藝中的關(guān)鍵元素。培養(yǎng)基配方中包含異種或未定義的化合物以及對細(xì)胞功能所涉及的多種分子和細(xì)胞機(jī)制的不理解是需要解決的主要問題。培養(yǎng)基和添加物中的異種成分具有潛在危險(xiǎn)，因?yàn)樗鼈兛赡芎锌蓚鞑ソo培養(yǎng)細(xì)胞的致病因子，從而阻礙其用于醫(yī)療應(yīng)用。例如，胎牛血清 (FBS) 是一種低分子量和高分子量生物分子的異種復(fù)合混合物，傳統(tǒng)上被包含在培養(yǎng)基配方中以促進(jìn)細(xì)胞生長。然而，眾所周知，它們的生產(chǎn)批次間含量存在顯著差異，從而改變了生物分子的批次間濃度和工藝的可重復(fù)性。這在GMP級干細(xì)胞培養(yǎng)中必須完全避免，因?yàn)樗赡芎胁涣家蛩?，如：?nèi)毒素、支原體、病毒污染物和朊病毒蛋白。

干細(xì)胞培養(yǎng)配方中經(jīng)常添加促進(jìn)未分化狀態(tài)細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子和生長因子。這些添加物通常來自異種來源，因此它們在臨床干細(xì)胞培養(yǎng)中的使用也受到阻礙。但目前已經(jīng)有很多無異種材料的開發(fā)和干細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用，而有關(guān)使用無異種培養(yǎng)基的報(bào)道已證實(shí)了細(xì)胞的擴(kuò)增能力及其在整個(gè)培養(yǎng)過程中保持分化潛能的能力。

細(xì)胞分離

細(xì)胞與微載體分離是直接影響細(xì)胞活力的重要步驟。目前，已經(jīng)開發(fā)了不同的分離策略，這些策略與基于微載體的生物工藝完全兼容。其中，基于蛋白水解酶的方法最為常用。傳統(tǒng)上，胰腺衍生的牛和豬胰蛋白酶是廣泛用于細(xì)胞分離的酶。盡管這些酶很有效，但它們的動物來源使其無法用于醫(yī)療環(huán)境，必須探索無異種替代品。重組胰蛋白酶樣酶，如 TrypLE 和 TrypZean是解決胰蛋白酶使用不便的辦法。雖然這些酶在不同的生物體中表達(dá)，但它們在不同的比較研究中表現(xiàn)出與胰蛋白酶相似的干細(xì)胞分離活性。

另一個(gè)需要考慮的因素是酶孵育時(shí)間對細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物的影響。如研究顯示，胰蛋白酶在 30 分鐘時(shí)會降低多種細(xì)胞表面表達(dá)標(biāo)志物，而 TrypLE 不會影響任何一種。另有研究顯示，MSC過度暴露于 TrypLE 酶（60 分鐘）可顯著降低多能性表達(dá)標(biāo)志物。酶孵育時(shí)間是成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離而不影響細(xì)胞完整性和活力的重要參數(shù)。雖然較長的酶孵育時(shí)間與細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡有關(guān)，但由于蛋白質(zhì)鍵的不完全斷裂，短時(shí)間會阻礙細(xì)胞分離。因此，必須嚴(yán)格規(guī)范細(xì)胞與酶的接觸時(shí)間，以防止細(xì)胞活力及其特性的下降。為了克服這種時(shí)間上的挑戰(zhàn)，研究將胰蛋白酶孵育與攪拌相結(jié)合，這減少了酶孵育時(shí)間并減少了細(xì)胞對酶活性的過度暴露。

其它的替代方案是使用刺激響應(yīng)性材料來克服酶促分離的缺點(diǎn)。這些材料可以與外部刺激發(fā)生反應(yīng)，例如溫度、pH 值或電解質(zhì)濃度的變化，從而導(dǎo)致其尺寸/大小、結(jié)構(gòu)、溶解度或分子間相互作用發(fā)生改變。從這個(gè)意義上說，目前的趨勢是尋找簡化分離過程并減少或最終消除酶使用的新材料。用于藥物遞送系統(tǒng)、納米顆粒和組織工程應(yīng)用的新型材料可以推廣到微載體的制造。

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